La nascita della Biblioteca Leonardiana è legata strettamente alla figura di Gustavo Uzielli, uno dei maggiori studiosi di Leonardo da Vinci della seconda metà dell'Ottocento. I suoi sforzi e quelli dell'amministrazione di Vinci, nell'ultimo decennio degli anni Novanta, per la costituzione di una biblioteca vinciana nel paese natale di Leonardo, si sarebbero realizzati vari anni dopo, nel 1928, anche a seguito dell'acquisizione nel 1911 del fondo leonardiano della biblioteca privata di Gustavo Uzielli da parte del Comune di Vinci.
Diventata ben presto uno dei centri principali per gli studi leonardiani in Italia, la biblioteca è andata nel tempo costituendo una collezione estremamente ricca di quanto edito di e su Leonardo da Vinci, in particolare dai primi decenni del Novecento fino ad oggi. Con il catalogo a stampa Bibliotheca Leonardiana, 1493-1989 di Mauro Guerrini, che descrive le collezioni leonardiane della Biblioteca di Vinci, dell'Ente Raccolta Vinciana di Milano e della Raccolta Carlo Viganò presso l'Università Cattolica del Sacro Cuore di Brescia, l'istituto vinciano è diventato promotore di un progetto di pubblicazione di un'ampia bibliografia specializzata che ha unito le risorse delle principali raccolte italiane su Leonardo da Vinci.
Nel corso degli anni '90 del 1900 la Biblioteca Leonardiana si è andata sempre più configurando come centro non solo documentario, ma anche di informazione bibliografica, per gli studi leonardiani. Ha sviluppato uno strumento fondamentale quale il proprio archivio in linea, il quale comprende: il catalogo delle opere e dei documenti posseduti dalla biblioteca; la BIL: Bibliografia Internazionale Leonardiana, che aggiorna sistematicamente il repertorio bibliografico delle opere di e su Leonardo da Vinci e include bibliografie tematiche, alcune delle quali dedicate a protagonisti degli studi leonardiani.
In collaborazione con altri istituti, a partire dal 2005 ha progettato e sviluppato e-leo: archivio digitale di storia della tecnica e della scienza, un archivio, in continua implementazione, che tramite le nuove tecnologie offre uno strumento più avanzato di studio in primis delle opere di Leonardo da Vinci e poi di altri autori del Rinascimento.
Le opere a stampa attualmente posseduti sono più di 15.000, di cui circa 11.000 di e su Leonardo da Vinci. Comprendono le riproduzioni in facsimile dei manoscritti e disegni, le edizioni di tutte le opere a stampa a partire dalla prima edizione del 1651 del Trattato della pittura; monografie e contributi di varia natura sui diversi ambiti disciplinari dell'attività del Vinciano.
Arricchisce la collezione libraria: una sezione di reference dedicata alle fonti dell'opera leonardiana e a studi su Quattro- e Cinquecento; una serie di periodici specializzati, alcuni strettamente dedicati agli studi leonardiani, altri di argomento più generale che vanno dalla storia dell'arte a quella della scienza e tecnica; alcuni fondi librari, documentari ed epistolari; materiali grafici di vario tipo; una raccolta di oltre 35.000 ritagli stampa degli anni 1938-1999 tratti da periodici italiani di argomento per lo più leonardiano disponibili in versione elettronica.